SPEKTROFOTOMETER
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrofotometer digunakan untuk mengukur transmitans dan absorbance suatu sampel dengan panjang gelombang tertentu.
Terdapat beberapa jenis spekrofotometer seperti spektrofotometer AAS , spektrofotometer inframerah, spektrofotometer UV – Vis,spektrofotometer resonansi magnetic, spektrofotometer pendar molecular dan spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya.
Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :
1. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.
2. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks
3 Penyerapan oleh perpindahan muatan.
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi.
A.Filter Sinar
λ (nm) <400 400-450 450-500 500-570 570-590 590-620 620-750 >750
warna UV Violet Biru Hijau Kuning Jingga Merah Infra Merah
B. Beberapa jenis spektrofotometer :
1. Spektrofotometer UV-Vis
2. Spektrofotometer Infra merah
3. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA)
4. Spektrofotometer Resonansi Magnetik (NMR)
5. Spektrofotometer Pendar Molecular (pendar fluor/pendar fosfor)
6. Spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya ( nefelometer, turbidimeter dan spektrofotometer Raman)
C. Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :
1. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.
2. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks
3 Penyerapan oleh perpindahan muatan.
Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sebagai berikut :
E = hv
Dimana,
E = energy (joule/second)
h = tetapan plank
v = frekuensi foton
Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pd sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor (gugus dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron. Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan.
Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik).
Komponen dari suatu spektrofotometer berkas tunggal
1. Suatu sumber energy cahaya yang berkesinambungan yang meliputi daerah spectrum dimana instrument itu dirancang untuk beroperasi.
2. Suatu monokromator, yakni suatu piranti untuk mengecilkan pita sempit panjang-panjang gelombang dari spectrum lebar yang dipancarkan oleh sumber cahaya.
3. Suatu wadah sampel (kuvet)
4. Suatu detector, yang berupa transduser yang mengubah energy cahaya menjadi suatu isyarat listrik.
5. Suatu pengganda (amplifier), dan rangkaian yang berkaitan membuat isyarat listrik itu memadai untuk di baca.
6. Suatu system baca (piranti pembaca) yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan (% T) maupun Adsorbansi (A).
Skema spektrofotometer :
Sumber Cahaya..Monokromator….Sampel…Detektor….Amplifier..Piranti Pembaca/ Penunjuk
Hubungan antara warna dengan panjang gelombang sinar tampak :
Panjang gelombang warna yang diserap warna komplementer
400-435 nm ungu (lembayung) hijau kekuningan
450-480 nm biru kuning
480-490 nm biru kehijauan orange
490-500 nm hijau kebiruan merah
500-560 nm hijau merah anggur
560-580 nm hijau kekuningan ungu (lembayung)
580-595 nm kuning biru
595-610 nm orange biru kekuningan
610-750 nm merah hijau kebiruan
Pergeseran-pergeseran :
1. Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan energy yang lebih rendah.
2. Hypsokromik(pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih pendek.
3. Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar.
4. Hypokromik, reduksi absortivitas molar.
Beberapa Istilah Dalam Spektrofotometri
Absorbans (A), A = log (Po/P)
Absorptivitas (a), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan dalam %b/v dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per gram per sentimeter.
Absorptivitas molar (ε), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan dalam molar dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per mol per sentimeter.
Transmitan (T), fraksi dari daya radiasi yang diteruskan oleh suatu sampel T = P/Po. Sering dinyatakan sebagai suatu persentase : %T = (P/Po) x 100%.
Penerapan spektrofotometrik
Hukum Beer
Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan.
Hukum Bouguer (Lambert)
Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen dalam lapisan-lapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang memasuki lapisan itu dalam fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan semuanya yang lain sama, maka absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan yang melewati medium.
Gabungan Hukum Bouguer-Beer, sering di tuliskan sebagai A = abc atau A = εbc
Dengan:
A = absorbans
ε = absorpsivitas molar (jika konsentrasi dalam molar) dengan satuan M-1cm-1
a = absorpsivitas (jika konsentrasi dalam %b/v) dituliskan E1%1cm
b = panjang jalan/kuvet
c = konsentrasi ( dalam molar atau %b/v)
Spektra absorpsi sering diyatakan dalam %T maupun dalam bentuk A (absorbansi)
Maka,
A = - log (%T)
A = log (Po/P), Po adalah daya cahaya masuk dan P adalah daya yang diteruskan melewati sampel.
2.6 Spektrofotometri
Spektrofotometri digunakan untuk mengukur kadar dan kemurnian DNA/RNA. Cahaya UV diserap oleh struktur molekul yang berbentuk cincin. Struktur cincin ini dimiliki tidak hanya oleh asam nukleat namun juga dimiliki oleh protein, lipid dan lain sebagainya. DNA dan RNA dapat menyerap secara kuat pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Protein seperti asam amino W,P, Y juga menyerap secara kuat pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Larutan yang digunakan untuk mengkalibrasikan spektrofotometri ini adalah TE dengan pH tertentu. Kemurnian DNA dapat dilihat dari nilai perbandingan sebagai berikut:
DNA A260/A280 ~1. 8
RNA A260/A280 ~2. 0
Konversi nilai OD dengan jumlah DNA adalah konstan yaitu 50 ?g/ml setiap nilai OD 260 nm. Sedangkan untuk RNA adalah 40 ?g/ml setipa nilai OD 260 nm (David, 2005).
Panjang gelombang yang dipergunakan (Nick, 2007): " 230 nm :
Garam guanidium (dipergunakan untuk memfasilitasi pengikatan DNA pada kolom silika) dan fenol (dipergunakan dalam ekstraksi fenol/kloroform) menyerap dengan kuat pada 230nm, sehingga absorbansi tinggi pada panjang gelombang ini dapat menjadi indikasi keberadaan keberadaan komponen-komponen tersebut pada sampel. " 260 nm:
DNA menyerap cahaya dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm sehingga nilai absorbansi pada panjang gelombang tersebut (A260) dapat dipergunakan untuk memperkirakan konsentrasi DNA dengan persamaan : konsentrasi (µg/ml) = (A260 - A320 ) × 50 yang diturunkan dari hukum Beer. " 280 nm :
Residu tirosin menyerap dengan kuat pada panjang gelombang ini sehingga nilai absorbansinya dapat dipergunakan sebagai indikator kontaminasi protein.
" 320 nm :
" 320 nm :
A320 menyediakan pengukuran umum turbiditas sampel dan secara normal disubstraksi dari nilai A260 sebagai pembacaan latar kalkulasi konsentrasi DNA, tetapi nilai yang berlebih dapat mengindikasikan adanya kontaminan non-spesifik.
Sampel DNA yang berkualitas baik memiliki rasio A260/A280 yang berkisar antara 1.7-2.0 dan rasio A260/A230 lebih besar daripada 1.5. Akan tetapi, teknik yang berbeda memiliki sensitifitas yang bervariasi terhadap kontaminan sehingga nilai-nilai tersebut hendaknya hanya diambil sebagai pedoman kemurnian sampel. Untuk pengukuran yang akurat, nilai A260 harus berkisar antara 0.1 dan 1 sehingga pengenceran sampel yang terkonsentrat mungkin diperlukan (Nick, 2007).
Sampel DNA yang berkualitas baik memiliki rasio A260/A280 yang berkisar antara 1.7-2.0 dan rasio A260/A230 lebih besar daripada 1.5. Akan tetapi, teknik yang berbeda memiliki sensitifitas yang bervariasi terhadap kontaminan sehingga nilai-nilai tersebut hendaknya hanya diambil sebagai pedoman kemurnian sampel. Untuk pengukuran yang akurat, nilai A260 harus berkisar antara 0.1 dan 1 sehingga pengenceran sampel yang terkonsentrat mungkin diperlukan (Nick, 2007).
2.7 Visualisasi DNA
DNA secara alami tidak memiliki warna sehingga visualisasi DNA sangat diperlukan selain melalukannya pada gel. DNA mungkin dilabel dengan radioaktif dan dideteksi dengan autoradiografi. Alternatifnya, gel dapat diwarnai dengan etidium bromida yang berikatan dengan kuat dan spesifik pada DNA dan RNA. Etidium bromida berinterkalasi di antara pasangan-pasangan basa DNA dan RNA sehingga DNA berikatan lebih banyak dengan etidium bromida dibandingkan dengan RNA. Setelah pita menempati lokasi yang ditentukan, pita tersebut dapat dipotong dari papan agarosa dan DNA diekstraksi untuk menghasilkan fragmen yang murni (Clark, 2005).
Spektrometer absorbsi adalah sebuah instrumen untuk mengukur absorbsi/penyerapan cahaya dengan energi (panjang gelombang) tertentu oleh suatu atom/molekul. Spektrofotometer dikembangkan beberapa puluh tahun lalu untuk keperluan para fisikawan dan kimiawan dalam mempelajari struktur molekul dan mengembangkan dengan teori molekul. Kini, spektrofotometer juga banyak digunakan untuk berbagai seperti studi bahan, lingkungan ataupun untuk mengontrol suatu proses kimiawi dalam industri. Amersham Biosciences adalah perusahaan intrumentasi yang memfokuskan diri dalam pengembangan spektrofotometer untuk keperluan penelitian Biologi molekuler. Setiap laboratorium Biologi pasti memiliki spektrofotometer sebagai salah satu tools modernnya.
Proses Absorbsi
Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi antara gelombang cahaya (foton) dan atom/molekul. Energi cahaya diserap oleh atom/molekul dan digunakan oleh elektron di dalam atom/molekul tersebut untuk bertransisi ke tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Absorbsi hanya terjadi jika selisih kedua tingkat energi elektronik tersebut (ΔE = E2 – E1) bersesuaian dengan energi cahaya (foton) yang datang, yakni
ΔE = Efoton.
Untuk molekul organik, dalam banyak hal, absorbsi cahaya UV/Vis (ultraviolet/visible) terjadi pada group fungsional (kromofor) yang mengandung elektron-elektron valensi. Proses absorbsi cahaya UV/Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan tingkat energi elektronik tertentu ke orbital molekul lain dengan tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Transisi elektronik tersebut biasanya adalah σ σ* σ*atau n σ* (bersesuaian dengan energi cahaya UV), dan π π*atau n π * (bersesuaian dengan energi cahaya Vis), seperti ditunjukkan dalam gambar di bawah ini.
Gambar di bawah menunjukkan plot %T vs. c dan A vs. c. Bentuk persamaan terakhir menyatakan sebuah hubungan penting, yakni absorbansi A memiliki hubungan linier dengan konsentrasi c (A µ c) dan dapat ditentukan dengan mengukur ratio antara intensitas cahaya setelah melewati bahan/medium dan intensitas sebelum melewati bahan/medium.
Karena sifat hubungan linieralitas antara A dan c, penentuan konsentrasi bahan/sampel dapat dilakukan dengan lebih mudah jika bekerja dengan absorbansi A daripada bekerja dengan transimisi %T. Konsentrasi dapat ditentukan lewat perkalian atau pembagian sederhana dari nilai koefisien molar ekstinsi yang telah diketahui. Tabel di bawah ini menunjukkan nilai koefisien molar ekstinsi untuk deoxynucleoside triphosphates:
| Deoxynucleoside triphosphates | Absorbsi maksimal (lmaks) | koefisien molar ekstinsi εmaks (10-3) |
| dATP | 259 | 15.4 |
| dCTP | 271 | 13.0 |
| dGTP | 252 | 13.6 |
| dTTP | 267 | 9.9 |
Nilai konsentrasi dapat dihitung dengan mudah dengan menggunakan persamaan Beer-Lambert di atas.
Beberapa molekul, termasuk juga DNA seperti terlihat dalam Tabel di atas, memiliki absorbansi yang tinggi. Pada daerah dengan konsentrasi tinggi, kurva absorbansi tidak lagi berbanding lurus dengan konsentrasi tetapi mengalami deviasi akibat saturasi. Untuk mendapatkan akurasi yang lebih baik, sebaiknya pengukuran dilakukan pada daerah absorbansi A < 2 yang dapat dicapai lewat pengenceran.
Instrumentasi
Gambar di bawah ini menunjukkkan skema dari konstruksi spektrofotometer yang paling sederhana, yang terdiri dari :
2. monokromator, yang berfungsi sebagai penyeleksi cahaya dengan panjang gelombang (energi) tertentu.
3. kompartemen sampel
4. detektor dan pengukur intensitas cahaya.
Bergantung pada daerah spektum yang akan dieksplorasi, spektrofotometer ada yang dirancang hanya memiliki sumber cahaya tampak saja (Vis), dan ada yang dirancang memiliki sumber cahaya tampak (Vis) dan ultraviolet (UV). Untuk spektrometer Vis, sumber cahaya yang digunakan biasnya adalah lampu tungsten halogen (W). Spektrometer UV-Vis menggunakan kombinasi lampu tungsten halogen dan lampu deuterium (D2). Pada beberapa model spektrofotomer digunakan lampu Xenon. Meski spektrofotomer dengan lampu Xenon hanya bisa mengkover sebagian daerah UV, yakni pada daerah panjang gelombang lebih besar dari 300 nm, tetapi spektrofotometer ini menawarkan nilai ekonomis yang lebih baik karena lampu Xenon relatif lebih panjang umur hidupnya dan lebih murah harganya. Tabel di bawah ini menunjukkan beberapa tipe spektrofotometer dan jenis lampu yang digunakan.
| Tipe | Jenis lampu |
| Ultrospec 6300, 5300, 4300, 3300, 1100 pro UV/Visible Spectrophotometer | D2 dan W |
| Ultrospec 3100, 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Xenon |
Pada awalnya, kebanyakan spektrometer dibangun dengan teknik optika sinar ganda (double beam optics). Dengan berkembangnya dunia mikroprosesor secara pesat, kemampuan kerja sebuah spektorofotometer dapat dioptimalkan dengan mengintegrasikan sebuah mikroprosesor ke dalam sistem spektrofotometer tersebut. Selain menggantikan fungsi kontrol analog dalam spektrofotometer model lama, pemanfaatan mikroprosesor menghadirkan fungsi-fungsi baru. Seperti terlihat dalam sekma di bawah ini, mikroprosesor menjadi “otak” dari sebuah spektrofotomer yang berfungsi
- mengontrol komponen optik dan mekanik,
- menyimpan dan melakukan operasi aritmatik,
- melakukan komunikasi, baik satu arah (lewat display atau printer) maupun dua arah (dengan komputer)
Dengan memanfaatkan kemampuan sebuah mikroprosesor dalam menyimpan memori dan melakukan operasi aritmatik, spektrofotometer tidak perlu lagi dibangun dengan teknik optika sinar ganda, melainkan cukup dengan teknik optika sinar tunggal (single beam optics). Nilai absorbansi dari sel referens disimpan di dalam memori. Nilai absorbansi sampel sesungguhnya diperoleh dengan mengurangi nilai absorbansi hasil pengukuran dengan nilai absorbansi referens tadi. Dengan menggunakan nilai absorbansi tadi, mikroprosesor dapat diperintahkan untuk menghitungnya menjadi nilai transmitansi, konsentrasi, ratio kandungan tertentu terhadap kandungan lainnya, dsb. Dengan demikian, informasi yang ingin dicari lewat pengukuran dapat langsung diperoleh.
Spektrofotometer produksi Amersham Biosciences memiliki feature/performance yang unik sesuai dengan kebutuhan instrumentasi untuk laboratorium Biologi modern, yakni:
1. Dibangun dengan menggunakan teknik optika sinar tunggal (single beam optics) yang dilengkapi dengan mikroprosesor, sehingga
- berbentuk kompak dan mudah dipindah-pindahkan,
- kalibrasi sepenuhnya berjalan otomatis setiap kali instrumen dihidupkan sehingga hasil pengukuran terjamin ketepatannya (validasi data),
- error atau deviasi hasil pengukuran akibat komponen bergerak (moving parts) di dalam spektrofotometer dapat diminimalkan,
- selain nilai absorbansi, nilai transmitansi, konsentrasi, ratio konsentrasi kandungan bahan (misal, ratio DNA/protein), kemurnian dsb. dapat langsung diperoleh pada tampilan keluaran tanpa harus melakukan perhitungan secara manual seperti pada spektrofotometer generasi sebelumnya.
2. Dibangun dengan menggunakan detektor fotodioda silikon. Dibandingkan dengan menggunakan detektor fotomultiplier, sistem dengan detektor fotodioda memiliki kelebihan dalam hal waktu pengukuran yang lebih singkat, energi listrik yang lebih rendah, dan juga rangkaian listrik yang lebih sedikit.
3. Dibangun dengan menggunakan mikroprosesor yang dapat berkomunikasi dengan personal computer, sehingga instrumen dapat dioperasikan secara “stand-alone” atau dikontrol oleh personal computer. Modus operasi terakhir sangat bermanfaat karena dengan bantuan program SWIFT (keluaran dari Amersham Biosciences juga)
- metoda dan waktu pengukuran dapat direncanakan lebih mudah,
- database hasil pengukuran dapat dikerjakan dengan mudah,
- tersedia beberapa fasilitas untuk analisa data
Analisa data lebih rinci dan komprehensif dapat dilakukan setelah pengukuran sehingga instrumen dapat lebih awet (ingat bahwa secara alami umur hidup lampu terbatas hanya berkisar 1000 jam).
GAMBAR SPEKRTROFOTOMETER UV VIS
0 comments:
Post a Comment